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免疫印迹最重要也是最后一步就是酶与底物反应进行检测，本试剂盒以化学荧光发光方法检测蛋白质或核酸类生物大分子。其原理是，蛋白质或核酸在电泳后转移到印迹膜上，以一抗及辣根过氧化物酶HRP标记的二抗结合膜上的目的蛋白，或以HRP标记的探针直接或间接结合膜上的核酸。洗膜后用本制品配制的ECL工作液，在可见光下室温孵育膜数分钟，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒。然后转入暗室将X光胶片压在膜上曝光数秒到数分钟至数小时。显影定影后蛋白质或核酸条带可清晰显示在X光胶片上。也可不进行X光胶片曝光直接对印迹膜进行荧光CCD扫描。

• ECL工作液配制过程中吸取试剂A和试剂B时务必跟换吸头，工作液新鲜配制后立即使用，放置过久会影响灵敏度。
  
• 根据蛋白丰度不同曝光时间可能是数秒至数小时。
  
• 曝光时间过长会使背景加深，曝光不足会导致条带模糊。
  
• 如果曝光后条带不佳，可用洗膜缓冲液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL发光和曝光。
  
• 应使用高质量保鲜膜。

• 使用合适的方法进行Western，直至用PBST洗涤二抗。
  
• 新鲜配制ECL工作液：试剂A和试剂B按1:1混合后，用双蒸水10倍稀释，混合后即为ECL工作液。须立即使用！
  
• 印迹膜蛋白面朝上，用ECL工作液均匀滴加至印迹膜室温孵育1～2分钟。ECL工作液使用量大约为0.125mL/cm2膜或根据个人实验习惯使用。
  
• 用平头镊夹住印迹膜，垂直置于吸水纸以吸去多余工作液。
  
• 快速将印迹膜置于二层保鲜膜之间，尽量赶尽气泡。
  
• 将印迹膜蛋白面朝上，放于X光胶片暗盒内。在暗室内放入X光片，曝光，显影。